分離細菌的方法很多，常用的有以下幾種。

　　將被檢材料接種于適宜培養基，再于固體培養基表面生長的菌落中，選樣欲分離菌的單個菌落，移種于另一適宜培養基中培養。因為一個菌落通常由一個細菌生長繁殖所形成，故培養出的細菌是單一的種類，即純培養。

　　用特殊的培養環境(如厭氧、二氧化碳環境等)分離細菌。

　　將被檢材料接種子易感動物體內，使病原菌在動物體內繁殖，然后從動物體內取材料利用離心機進行離心分離出需要的成分后培養。利用某些細菌對一些理化因素有特殊抵抗力，用理化方法處理接種材料，殺死其他微生物而保存需要的細菌，再分離培養。

　　一般情況下，被檢材料用前兩種方法分離培養即可。如披撿材料污染嚴重，可先用后兩種方法處理，再用前兩種方法獲得純培養。

　　在分離培養操作中，嚴格遵守無菌操作。所有用具、培養基、試劑都要經過滅菌，而且不能長時間暴露于空氣中。禁止用手接觸或用口吹已滅菌的器皿內部。

　　根據被檢材料中可能存在的病原苗的特性，選擇適當的培養基和培養條件：(溫度、氣體環境等)。進行未知菌的初次分離，多用幾種培養基，如肉湯、鮮血瓊脂、麥康克瓊脂等，每種培養基接種數管，分別放在普通環境和厭氧環境中培養。一般經過24—78小時觀察結果，但也有一些病原菌，需要培養校長時間才能生長。　　

　　被檢材料一般不需要處理，直接按種于培養基上。當懷疑為有芽腦的病原苗時，可將被檢材料加生理鹽水磨碎，作成1：10乳劑(液體材料不必稀釋)，置60-80℃水浴中20—30分鐘，以殺死無芽胞的雜菌，然后再接種于培養基中。